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28色方案,让树突状细胞分群更精细
点击次数:399 发布时间:2019-05-27

 

如何利用28色方案,让树突状细胞分群更精细

 

为什么要研究树突状细胞?

T和B淋巴细胞是适应性免疫系统的基本效应细胞,但APC(抗原递呈细胞)作为其上游,起着守门员的角色,几乎可以启动和塑造任何适应性免疫反应。树突状细胞(DC)就是APC中递呈抗原能力ZUI强的一种。
越来越多的证据表明,DC对于致耐受性或促炎性局部免疫环境是至关重要的,因此,在自身免疫性疾病以及癌症等疾病中,将DC的生物学机制研究清楚,就可能揭示治疗干预的新方法。

那么如何精细分出DC亚群呢?

在过去的十年中,小鼠和人类树突状细胞分类逐渐细化,这在很大程度上得益于流式细胞术和单细胞RNA测序(sc-RNAseq)领域的技术发展。
在此,我们根据新的基于sc-RNAseq的分类,设计了28色方案来深入区分人DC亚群。大致思路如下:

  1. 采用CD45以在非淋巴组织样品中区分造血细胞与污染的基质细胞。

  2. 为区分DC亚群,用CD11c、HLA-DR、CD141(也称为BDCA-3,标记cDC1)、CD1c(BDCA-1,标记cDC2)和CD123(pDC)。

  3. 增加15个表面分子,每个表面分子与炎症性疾病或抗肿瘤免疫的DC功能相关:共刺激分子CD40、CD80和CD86;低亲和力Fc-受体CD16(FccrIIIa)和CD32(FccrIIa/b);趋化因子受体CCR7和CX3CR1;清道夫受体CD163;补体受体CD11b;CD85k(也称为ILT-3);BTLA(CD272,也称为B和T淋巴细胞衰减分子);CD26,CD38和CD172(也称为Sirpa)。

  4. 为了更精准地圈门,加上了排除性的谱系标记物CD3(pan T细胞)、CD14(经典单核细胞)、CD19(B细胞)、CD56(NK细胞)以及CD4和CD8。

  5. 结合CCR7和CD45RA,该方案同时可评估T细胞亚群的分化状态。值得注意的是,CCR7也被证明是DC向引流淋巴结迁移所必需的。

详细

分析步骤详解

第一步,首先是常规的圈取液流稳定部分、选择单个核细胞区域、排除粘连体、圈选CD45+活细胞区域。

第二步,通过CD16/CD14,圈出CD14+单核细胞和CD14-细胞,接着将CD14-细胞显示在CD19/CD3图上,圈出CD3+T细胞、CD19+B细胞、CD3-CD19-细胞,在这里CD3+T可通过CD4/CD8分为CD4+T、CD8+T、DNT三个主要亚群;

对CD4+T和CD8+T两个亚群,可进一步通过CCR7和CD45RA圈出其中Naive功能状态的亚群;而CD19+B细胞则可继续分析其CD80+的比例。

第三步,对第二步中圈出的CD14-CD3-CD19-部分细胞,进一步用CD56/CD123散点图分析,圈出CD56+NK、CD123高表达的pDC、CD56-CD123low的DC候选群体,接着可根据CD11c/HLA-DR,圈出准确的双阳性DC群体,最后根据CD141/CD1c分析DC(不包括pDC)中的三个亚群:CD141+DC、CD1c+DC、DN DC。

第四步,分析pDC、CD141+DC、CD1c+DC、DN DC四个亚群中CD26、BTLA、CD32、CD38、CX3CR1、CD85k、CD11b、sirpa、CD40、CD86、CD45RA的表达水平。

最后一步,利用FMO作为设门对照,分析总DC中CX3CR1、CD85k、CD40、CD163、CD86的表达水平。

而现在,BD FACSymphony™可以有效协助研究人员完成相关实验测定,在成为研究人员好帮手的同时,以其可靠的功能特性及稳定的数据结果赢得广泛的信赖。

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